柱式土壤DNA提取试剂盒

产品货号：KL-10173BTN

中文名称：柱式土壤DNA提取试剂盒

英文名称：Soil DNA column extraction kit

产品规格：50次

发货周期：1～3天

本试剂盒专门用于从各种土壤样品和河海沉积物中提取高质量的DNA的试剂。
试剂盒特点：
1.去污染效果更好，得到的DNA可以直接作为PCR模板或酶切，不需要再进行去腐殖酸处理。
2.操作过程更加简单快速，整个操作只需要10多分钟，扩容性好。
3.产量高，每克土壤一般可以提取到5～50μg DNA，片段长度在20～50 Kb，OD260/280一般都在1.8以上。
4.适合于各种土壤(包括河海沉积物)。
试剂盒组成：

储存条件：常温运输及保存，保存期为一年。
使用方法：
1.65℃预热溶液A，待其沉淀溶化后充分混匀，取0.5mL加入到1.5mL塑料离心管中并放置于65℃待用。
2.称取0.1～0.3g的土壤，加入到含预热溶液A的离心管中，震荡器上剧烈震荡5～10分钟。如果是扩量操作，可以使用更多土壤和较大离心管。也可以将同一种土壤在较大离心管中震荡处理，然后再分到1.5mL离心管中。注意:不论使用大的还是小的离心管，一定要让管底的土壤震荡起来。
3.将离心管置于65℃水浴中保温至少5分钟。
4.12000～15000g室温离心3分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，实际颜色取决于腐殖酸的含量，上清液的体积一般为300～400μL)。
5.在上清液中加入等体积的溶液B，上下颠倒30秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
6.将离心管冰浴至少5分钟。
7.12000～15000g室温离心3分钟，转移上清到新的1.5mL离心管中，上清液颜色将比第4步得到的上清的颜色稍淡，体积在0.7mL左右。
 注意：下面第8-第9步的氯仿抽提操作可以省略，直接进入第10步，但DNA的产量会低50%左右，OD260/280在1.7-1.8。如果直接进入第10步，则转移的溶液体积不要超过0.6mL，否则没有空间加溶液C。
8.加入0.2mL的氯仿(自备)，震荡器上充分振荡30秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震荡起来。
9.12000～15000g室温离心3分钟，小心转移上清到新离心管中。说明：离心后两相交界面将有白色膜状物，其中有机相部分颜色较深，一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤中腐殖酸的含量。将上清转移到新的1.5mL离心管时，不要超过0.6mL，否则没有空间加溶液C。如果有多余的可以弃之不用。
10.加入1.5倍体积的溶液C，上下颠倒30秒混匀。
11.分两次上柱(即先转移一半的混合液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液，然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液)。
12.加0.7mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
13.如果有必要，可以再加0.3mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。增加一步洗涤能使最后得到的DNA的纯度稍有提高，但产量稍微有所降低。
14.12000～15000g室温再离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会污染DNA。
15.将离心吸附柱转移到一新的1.5mL塑料离心管中，加入50～100μL DNA洗脱液2.0。
16.室温放置离心吸附柱1～2分钟。
17.12000～15000g室温离心半分钟，离心管中溶液即为DNA样品，可以立即使用或存放于冰箱待用。

疑难解答：
Q:如何判断提取的DNA没有腐植酸污染？
A：方法一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测最大光吸收。注意：有腐植酸污Q:如何判断提取的ＤＮＡ没有腐植酸污染？
A：方法一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测最大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示DNA不能使用，有的腐殖酸并不抑制PCR扩增。
Q:腐殖酸的最大吸收波长是多少？
A：腐植酸(humic acid)是一大类呈棕黑色或黑色的物质，其结构千差万别，土壤中腐殖酸的组成和特点随土壤不同而不同，所以其最大吸收波长也各不相同，有的土壤的腐殖酸在260nm有最大吸收(见Appl.Environ.Microbiol.，63：4993，1997)，有的则在340nm。所以用特定的波长测定OD值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma，Fluke等公司出售的腐植酸产品成分一般比较简单，其最大吸收波长不能推广到成分更为复杂的土壤腐殖酸样品。
Q:是否腐植酸都会抑制后续的DNA反应？
A：否，因为腐植酸是一大类物质的统称，他们的结构和特性各不相同，所以是否对后续反应有影响最好通过实验来验证。如果用提取的DNA溶液原液进行反应而反应没发生，而对照样品(已知的不含污染的DNA)能够发生，说明可能抑制作用。
Q：如果得到的DNA样品还是含有抑制后续反应的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的DNA原液不能扩增，可以将样品稀释10倍和100倍再进行PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用我公司的PCR Inhibitor Scavenger。如果仍然不能解除，则可以通过柱式腐殖酸清除剂(BTN60801)或先电泳，再用超大片段胶回收试剂Magic Gel DNArc纯化土壤DNA，去除残留抑制剂。其中后两方法最有效，得到的原液一般可以直接扩增。
Q：在用土壤DNA进行细菌专一性PCR时，为何没加DNA模版的阴性对照有扩增产物出现？
A：这是由于使用的Taq DNA聚合酶一般从E.coli表达菌株中提取，提取过程中污染了E.coli的基因组DNA，而使用的广谱细菌专一性引物可以识别所有细菌DNA基因组DNA模版，所以会产生扩增。建议使用高质量的Taq DNA聚合酶。

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