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分子实验难，哈喽，我又来啦，今天带大家一起来了解PCR，相信大家都不陌生，毕竟经历了三年疫情生活的我们，已经了解到核酸检测利用的技术就是PCR！话不多说，今天就让我们揭开它的神秘面纱吧，到底是怎么个一回事呢？
01、它是什么？
PCR全称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），是一种非常强大的技术，可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
02、它是怎么完成扩增的呢？
1.高温变性
变性的目的是使模板DNA双链解旋成为单链以便与引物结合。此步骤将溶液加热至94-98C并保持20-30秒，破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子;同时也激活了DNA 聚合酶，该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.低温退火
退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5C左右。该步骤将持续约 20-40 秒，当反应温度隆低到50-65C时，引物与互补的DNA单链序列形成氢键，DNA聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
3.中温延伸
延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，沿着5’一3’的方向合成一条与模板DNA链互补的链。延伸时的温度通常为72C。
以上步骤为一个循环，此时已变成了两条DNA链，约需2~4分钟，每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍，PCR产物的量一般是以指数速率增长的，但后期由于底物dNTP的消耗以及DNA聚合酶的失活等因素，产量会逐渐减少，受到限制。通常一次PCR反应进行30-35个循环，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
03、PCR实验原理图？ 注：此图来自百度百科（图里面标注的①②③，对应的是扩增步骤：变性-退火-延伸） 04、实验前，我需要提前准备什么？
PS：DNA聚合酶一般分为普通的Taq聚合酶和高保真性聚合酶。若只是判断PCR产物是否存在特异性序列，选普通Taq聚合酶；若想要得到没有任何突变的PCR产物，需选择高保真聚合酶（以上是一般实验思维选择）。另外还需注意，进行T载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的，因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶
05、PCR实验步骤是什么呢？
图：PCR实验流程图