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技术文|终于将PCR一次性介绍清楚啦!

分子实验难,哈喽,我又来啦,今天带大家一起来了解PCR,相信大家都不陌生,毕竟经历了三年疫情生活的我们,已经了解到核酸检测利用的技术就是PCR!话不多说,今天就让我们揭开它的神秘面纱吧,到底是怎么个一回事呢?

01、它是什么?

PCR全称多聚酶链式反应(polymerase chain reaction),是一种非常强大的技术,可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

02、它是怎么完成扩增的呢?

1.高温变性

变性的目的是使模板DNA双链解旋成为单链以便与引物结合。此步骤将溶液加热至94-98C并保持20-30秒,破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子;同时也激活了DNA 聚合酶,该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。

2.低温退火

退火温度取决于所用引物的Tm,一般比引物Tm低3-5C左右。该步骤将持续约 20-40 秒,当反应温度隆低到50-65C时,引物与互补的DNA单链序列形成氢键,DNA聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。

3.中温延伸

延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,沿着5’一3’的方向合成一条与模板DNA链互补的链。延伸时的温度通常为72C。

以上步骤为一个循环,此时已变成了两条DNA链,约需2~4分钟,每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍,PCR产物的量一般是以指数速率增长的,但后期由于底物dNTP的消耗以及DNA聚合酶的失活等因素,产量会逐渐减少,受到限制。通常一次PCR反应进行30-35个循环,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

03、PCR实验原理图?


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注:此图来自百度百科(图里面标注的①②③,对应的是扩增步骤:变性-退火-延伸)

04、实验前,我需要提前准备什么?

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PS:DNA聚合酶一般分为普通的Taq聚合酶和高保真性聚合酶。若只是判断PCR产物是否存在特异性序列,选普通Taq聚合酶;若想要得到没有任何突变的PCR产物,需选择高保真聚合酶(以上是一般实验思维选择)。另外还需注意,进行T载体连接的时候,要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的,因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶

05、PCR实验步骤是什么呢?


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图:PCR实验流程图




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