Western Blot 试剂盒（兔），带 NC 膜 

产品名称：Western Blot 试剂盒（兔），带 NC 膜 

货号：KL80002规格：100ASSAYS 

产品简介:Western Blot 是根据抗原与抗体的特异性结合检测未知样品中的某种蛋白质的方法，由于具有高分辨率，高特异性及高敏感性，已成为蛋白质分析的常用方法。 

产品特点：

1. 试剂盒配备了转膜，封闭，二抗，显色等相关试剂，客户只需自备一抗即可进行 WB 实验，方便快捷。 

2. 所有试剂与 NC 膜一起足以分析总共 50~100 个样品。 

应用：WB 实验 

包装规格及成分：

储存条件：HRP-conjugated secondary IgG 和 DAB 保存在-20°C，试剂盒其他部分保存在 4°C，有效期 12 个月。 

转膜： 

1. 准备转膜缓冲液：加入一个准备好包装的转膜混合物和 200 mL 甲醇（如果需要），去离子水定容至 1000 mL。 

2. 切割滤纸和膜，用甲醇预处理的 PVDF 膜，将膜漂浮去离子水表面，直到其从下方开始完全润湿。 

3. 凝胶电泳完成后，从电泳室取出凝胶，切下含蛋白条带的凝胶。在凝胶右下角做一个小切口。 

4. 将凝胶浸入转移缓冲液中 20 min，将膜和滤纸也浸入转移缓冲液中。 

5. 用海绵和 3 张滤纸放置一个支架，用玻璃棒将所有的气泡赶出。 

6. 将凝胶放置在滤纸上，用玻璃棒将所有的气泡赶出。 

7. 将膜放置在凝胶的上面。在膜的右下角做一个小切口，以匹配凝胶右下角的切口，用玻璃棒将所有的气泡赶出。 

8. 将 3 张滤纸放置在膜上面，压出气泡。 

9. 在滤纸上方放置海绵，夹上转膜三明治。 

10. 将三明治置于转移室中，装满转膜缓冲液，确保膜面向正极方向。 

11. 进行转膜。 

12. 打开盒子，从膜上取出凝胶（凝胶可以用考马斯亮蓝染色来观察转印效率，膜可以用丽春红染色 10 min 观察转移效果，并用去离子水洗涤。 

免疫印迹： 

1. 制备封闭液：向 100 mL 1X TBS 中加入一袋备好的封闭剂。

2. 将膜放在热封袋中，每平方厘米膜加入 0.1~0.2 mL 封闭液，，尽可能地挤出空气，密封袋子，放在摇床上室温震荡 1 h。 

3. 切下热封袋的一角，排出封闭液。 

4. 每平方厘米膜加入 0.1~0.2 mL 封闭液，加入适当浓度的抗体，尽可能地挤出袋中空气，密封袋子，室温下在摇床上放置 1 h（或 4°C 摇床上过夜）。 

5. 在摇床上用 PBST（PBS 中含 0.05%Tween）洗涤膜 5 min，重复 3 次。 

6. 用 TBS 洗涤膜 10 min，每平方厘米的膜加入 0.1~0.2 mL 封闭液，加入适当浓度的 HRP 共轭二抗（1:2500~1:50000），尽可能地挤出袋中空气，密封袋子，室温下在摇床上放置 1 h。 

7. 在摇床上用 TBST（0.05%吐温）洗涤膜 5 min，重复 3 次。在 TBS 中再洗一次。 

8. 制备 DAB 底物溶液：a）将一包 DAB 溶于 10 mL 1X 显影溶液中，b）加入 10μl过氧化氢。 

9. 印迹反应显色。 

10. 预期条带出现后停止反应，倒出溶液并反复用蒸馏水冲洗。将膜干燥并置于黑暗中。 

Notes：

1. 对于 Western Blot 试剂盒（兔），带 NC 膜，当 HRP-共轭的山羊 IgG 抗体与牛奶中的组分反应时，可以使用 5%猪血清作为封闭液降低背景。 

2. 使用适当的手套，干净的的手术刀和钝头镊子来处理膜。膜和滤纸应比凝胶薄大约1 mm。 

3. 在设置传送盒的每一步都需要用玻璃棒赶出所有气泡。

4. 推荐稀释 HRP 共轭二抗的浓度是 1:2500~1:50000，如果印迹之后将用 ECL 或高背景观察，则二抗应进一步稀释（>1:100000）。

5. 在封闭好印迹步骤中，空气应尽可能从热封袋中挤出。 

6. 在 HRP 共轭 IgG 中使用叠氮化钠作为防腐剂能够大大抑制辣根过氧化物酶的酶活性。

7. 不要在印迹过程中立即使用膜，应彻底干燥并在室温下保存。

注意事项：

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 

2. 本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序，不能使用本产品作为食品、化妆品或家庭用品等。您使用本产品必须遵守产品说明页上适用的全部许可要求。阅读、了解并遵守此类声明的所有限制性条款是您的责任。