组织无机磷含量测试盒/分光光度法

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

无机磷主要指磷酸根,参与生物体内多种代谢,包括能量代谢、核酸代谢、蛋白质磷酸化和脱磷酸化等等,此外促进碳水化合物的合成、转化和转运。

测定原理:

钼蓝与磷酸根生成 660nm 有特征吸收峰的物质,通过测定 660nm 光吸收可计算无机磷含量。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前配制,加入 20 mL 蒸馏水,充分溶解后加入试剂二(全部),混匀。
标准品:液体×1 支, 4℃保存。
无机磷提取:
按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定:
1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 660 nm,蒸馏水调零。
2. 打开水浴锅,调节温度到 40℃。
3. 空白管:取 EP 管,依次加入 500μL 蒸馏水,500μL 试剂三,混匀后置于 40℃水浴保温 10min,室温冷却 10 min 后于 660 nm 测定吸光度,记为 A 空白管。
4. 标准管:取 EP 管,依次加入 50μL 标准液,450μL 蒸馏水,500μL 试剂三,混匀后置于 40℃水浴保温 10min,室温冷却 10 min 后于 660 nm 测定吸光度,记为 A 标准管。
5. 测定管:取 EP 管,依次加入 50μL 上清液,450μL 蒸馏水,500μL 试剂三,混匀后置于 40℃水浴保温 10min,室温冷却 10 min 后于 660 nm 测定吸光度,记为 A 测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。
组织无机磷含量计算公式:
(1) 按照蛋白含量计算
无机磷含量(μmol/mg prot)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V 总÷Cpr=1×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
无机磷含量(μmol/g )= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V 总÷W=1×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
C 标准液:1mmol/L;V 总:上清液总体积,1mL=0.001 L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样品质量,g。
注意事项:
1. 试剂三需临用前配制,并且当天使用完毕。
2. 40min 内完成比色。
3. 检出限为 10μmol/L。

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