总一氧化氮合成酶(NOS)测试盒/比色法

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

一、测定原理:

NOS 催化 L-Arg 和分子氧反应生成 NO,NO 与亲核性物质生成有色化合物,在 530nm 波长下测定吸光度,根据吸光度的大小可计算出 NOS 活力。

二、试剂组成与配制:
试剂一:底物缓冲液 6ml 1 瓶,-20oC 以下避光冷冻保存 3 个月。临用前化冻摇匀。没有用完的试剂,可以-20oC 以下避光冷冻保存以备下次再用。
试剂二:促进剂淡黄色或白色粉剂?2 支,稀释液 0.6 ml 2 支。-20oC 以下冷冻保存 6 个月。测试前取稀释液一支 0.6ml 加入一支粉剂中充分混匀(即将 1.5ml 离心管反复颠倒,并将小离心管尖部的液体弹下来),测试后剩余的试剂可放入-20oC 以下冷冻保存,时间不超过一周。若发现粉剂变成黄褐色或咖啡色,则不可以再用。
试剂三:黄色显色剂 3ml 1 瓶,4oC 避光冷藏保存 3 个月。
试剂四:透明剂 3ml 1 瓶,室温保存 6 个月。天冷后会凝固,37℃水浴变澄清时再使用。
试剂五:终止剂 60ml 1 瓶,4oC 保存 6 个月。室温低会出现浑浊,37℃水浴至透明再用。
三、操作步骤:
(注:样本及试剂从冰箱取出,37℃水浴至溶解完全,试剂四和试剂五必须澄清透亮,再进行操作,否则会影响结果)

[注] :
1、a*为参考取样量及补足双蒸水的量,10%的大鼠肝组织 50~100 l,鼠血清 30 l,10%的大鼠肾匀浆 50l,狗血清 30 l,心肌培养液 100 l。
2、比色时注意管内有无结晶或混浊,若有结晶或混浊可放 37℃水浴锅内轻轻搅动几下,混浊或结晶消失后再比色。
五、正常参考值:
大鼠血清:18.69±3.97 U/ml(n=45)
10%大鼠肾匀浆:0.536±0.134 U/ml(n=19)
狗血清:20.57±3.39 U/ml(n=18)
心肌培养液:0.698±0.110U/ml(n=12)
六、注意点:
1、促进剂 现用现配,配好后尽量一日内用完,如有剩余则-20oC 以下保存不超过一周;未配制之前的 2 号促进剂和稀释液均应-20oC 以下保存,如淡黄色或白色粉末变成咖啡色或黄褐色颗粒则失效不可用。
2、NOS 活性低,稳定性差,样品或匀浆上清如不马上检测,应置-20oC 以下冷冻保存。
3、试剂一与配制好的试剂二应避免反复冻融。
4、室温低时,NOS 5 号会出现浑浊,如果已经在测试管中加入了 NOS 5 号,可将测试管对着灯光,观察有无结晶或浑浊。如果有结晶或浑浊,请将每只测试管 37oC 水浴锅中晃动 5 分钟,再比色。

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