在细胞培养的过程中,总是能遇到这样的问题——细胞中有小黑点,一些难消化长得慢的细胞总会出现黑点,还有一些有漂浮的死细胞,崩解之后形成黑点和碎片,但还有一些是霉菌或细菌真菌类的污染也会形成小黑点,小黑点对细胞状态和实验效果等都有影响,怎么区别小黑点是细胞碎片,细胞核还是细菌等污染呢?
先让我们来看看细胞遭受小黑点入侵后的灾难现场~ 小黑点之所以这么令人头痛,是由于它的数量会随着培养时间的增加而不断增加,当数量多到一定程度的时候,就会对细胞的生长造成一定的影响,严重影响科研的进展。在显微镜下观察时往往表现为没有光泽,体积较小的黑色颗粒。 下面小编跟大家分享下培养细胞过程中碰到过的小黑点。 化学或物理的强烈刺激(例如胰酶消化时间过长,吹打细胞太过用力等)往往会导致细胞死亡,产生很多的细胞碎片。在显微镜下进行观察时,可以看到很多呈不规则形态、没有光泽的颗粒粘附在细胞培养皿的底部。 建议:状态不好的细胞往往贴壁能力较强,因此切勿用移液器进行强力的吹打,从而损害了健康的细胞;另外,控制好胰酶消化的时间,只需要保证大部分正常的细胞被消化下来就可以了,然后更换新的细胞培养皿。 体外培养的动物细胞很容易受到培养环境因素的影响,例如营养成分的改变、氧的供给、毒素、细胞代谢产物的积累、pH、 剪切力、细胞密度及微生物污染等。这些环境的改变都有可能诱发细胞的凋亡,从而产生很多分泌的凋亡小体。凋亡小体大多游离在培养基中,但也有一些会通过暴露的核酸彼此之间相互黏连,从而形成一个棕色的凋亡小体团块,没有细胞光泽。 建议:细胞培养的过程中一定要控制细胞传代的时间,不能让细胞“长过”;不要使用过酸或者过碱的培养基进行细胞培养;选用内毒素含量较低的血清。 磷酸钙是常见的一种沉淀物,通常会使血清出现浑浊,并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点,这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动,因此经常被误认为是微生物污染。 建议:经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著增多,对于大多数的细胞而言是不需要进过高温灭活处理的。 对于细胞培养过程中的小黑点到底是什么,目前呼声最高的非黑胶虫莫属,但是小编查看了很多的资料,依旧不知道其为何方神圣。有人认为是从血清中来的一种原虫,有人认为是细菌,或是真菌,也有人认为是血清中的蛋白结晶,因此消灭黑胶虫的方式也是各式各样。 建议:如果污染的细胞数量不是很多,建议直接丢弃,或者重新复苏细胞进行培养。 黑胶虫的污染很难定性,大部分被黑胶虫污染的细胞都存在生长迟缓,培养基颜色没有明显改变的现象,更像是受到了支原体的污染。已有通过使用支原体去除试剂解决黑胶虫污染困扰的成功案例,为此Yeasen公司特别研发了针对支原体污染的一系列产品,包括支原体的检测,支原体去除,以及去除后防止支原体再度感染的支原体预防试剂。 一旦您在细胞培育的过程中发现有黑点生成,首先,要肉眼观察培育基是否混浊,然后,在镜下观察培育细胞生长的 状态,黑点是否游动。假如细胞被污染,微生物则会大量繁衍,培育基就会迅速变黄、变混浊。污染包含细菌污染、 支原体污染等。 1、细胞生长过老,破碎的细胞残骸; 2、血清质量不好,反复冻融的成果; 3、制造培育基的pH值偏高,不宜细胞生长; 4、制造培育基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点; 5、培育原代细胞中呈现小黑点,可能是原代组织中的杂质,多次传代可以消除。 1、尽可能地减少血清冻融次数。 2、培育基无需37℃水浴。 3、培育基坚持最佳PH值7.0- 7.2。 4、严格控制制造培育基的水质,容器定时刷洗。 5、掌握细胞传代的最佳时机,细胞切勿生长过老。