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如何养好细胞?细胞培养技巧分享

一、细菌污染

细菌污染最为常见,一旦操作稍有不当,就会引起细胞污染,细菌污染后显微镜下观察呈现有黑色细条沙状,当然,根据感染的细菌不同,所呈现的状态也不尽相同,有球形、杆状等,其次,培养液发黄,变浑浊,可明显看见培养皿中有细沙状的沉淀物,时不时还有异样气味发出,如下图所示:

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处理方法:

  在培养基中加入抗生素处理,可以用四环素,庆大霉素,或者链霉素,前两者的工作浓度是50 μg/mL;链霉素的工作浓度是100 μg/mL。但是,细胞本身也有影响,状态大不如从前,所以,防范于未然,正确操作、严格执行无菌操作规范,定期清理消毒培养设施才是关键!
二、真菌污染

  真菌污染培养液清亮透明,不会像细菌感染大爆发,所以很难早期发现,镜下有时候象丝状,有时候象珊瑚状,慢慢地会长出很细的黑色丝状物,这个时候,已经晚了,细胞很难救活了。

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处理方法:赶紧扔掉,不要再想挽救,即使再珍贵。然后彻底消毒灭菌培养间,CO2孵箱,器皿和培养液。

三、霉菌污染

  同真菌感染一致,因为培养液是清亮的,所以霉菌污染早期难以发现,等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,如同风中柳絮,一般不仔细看发觉不出来。细胞仍可生长,但时间一长,细胞的状态就变差,不再增长。见下图。

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  处理方法:建议果断舍弃该污染细胞,将环境彻底消毒,因为霉菌的顽固可能会导致下几批细胞都会污染,所以,采用酒精彻底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍,把水盘里加上饱和量的硫酸铜。千万不可大意

四、支原体感染

  培养液变浑浊,支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是细胞状态变差、生长变慢,在显微镜下观察可能会有小黑点,但培养基一般不发生浑浊。细胞传代以后就出现细胞间黑点,细胞空泡化,很多类似凋亡、坏死的细胞,最终细胞漂浮,完全死亡。

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处理方法:

  如果不是很珍贵的细胞的话,建议直接扔了吧。

五、黑胶虫污染

开始污染时对细胞无影响,当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。400倍显微镜下可见点状或片状游动小体,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。

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  处理方法:可以增加细胞的种板密度,以提高细胞的生存率,尽早处理细胞,越快越好。


二、细胞传代

根据细胞生长特性的不同,传代可分为悬浮细胞传代和贴壁细胞传代两种类型,对于悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代,或用离心法后,加入新培养基后再吹打分散进行传代;贴壁生长的细胞则用消化法进行传代,下面我们介绍传代培养的一些注意事项;


一、贴壁细胞传代如何使用胰酶?

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。

消化液浓度过高时,易造成培养基中细胞碎片增多,黑渣子增多,常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化,对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化,细胞密度过高超过80%时,采用分步消化法。胰酶储存在–20°C,解冻在4°C进行,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。

二、如何控制胰酶消化时间?

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤:消化过度细胞碎片增多,黑渣子增多,细胞会成片脱落,严重影响细胞活性,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞,建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录最佳消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

三、细胞抱团怎么处理?

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象,大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下,很可能会出现部分细胞抱团生长的现象,聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物,殃及周围的悬浮细胞,因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团,可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团,也可以尝试一下方法:将细胞悬液收集到15 ml离心管中,静置20 min左右,小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。

四、细胞内有空泡,是否是正常现象?

部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2,Ishikawa及一些耐药株等),这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡,则很可能是细胞状态不佳,可以通过调整血清浓度,控制消化,控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡,且单个细胞内空泡数目偏多,则可能细胞代次较高,细胞老化所致,需更换代次较早的细胞。

五、细胞生长逐渐变慢是什么原因?

细胞增殖变慢有以下原因:1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。

六、细胞何时进行传代较好?

一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代,所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了),但有接触抑制的细胞,在汇合前就必须进行传代,这类细胞一般在密度70-80%就进行传代,否则会引起细胞分化。


三、细胞的复苏于冻存

一、复苏

1)取出冻存管,立即放入37度水浴箱中快速解冻(1分钟左右),水面不可没过盖子,以避免污染。

2)将冻存管移至无菌操作内。打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中,1000rpm, 5min,弃上清。

3)加入适量完全培养基,置于37度恒温箱中培养即可。

4)次日更换一次培养液,以去除任何残留的冷冻保护剂,继续培养。


二、冻存

1)用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基;

2)加入少量 PBS 冲洗二遍, 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来,依据传代的方法把细胞 悬液收集于离心管中,离心 1000 rpm,5-8 min; 

3)小心弃上清液,加入配置好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,然后将含有 细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中,每个冻存管加液 1-1.5 ml,细胞最终密度为 (5—10)×106 /ml; 

4)冻存管封口,做好标记,按照以下程序冻存:

第一种方法:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达到-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-150℃时,则可迅速浸入液氮中。

第二种方法:冻存管放入4℃,约30 min,﹣20℃ 30min- 60 min,见细胞悬液结冻后,放入﹣80 ℃冰箱, 过夜后转入于液氮罐中。 

第三种方法:将冻存管放于程序降温盒中,并置于-80℃冰箱4h以上,转入液氮罐中长期保存。



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