一、Western 实验中细胞的采集、处理和保存
1、贴壁细胞,加1ml PBS清洗,弃上清,加RIPA(六孔板200ul,培养瓶400ul)冰上消化半小时,细胞刮板,将RIPA转移至EP管,用枪吹打细胞RIPA液200次;
2、细胞团块,加1ml PBS重悬细胞,分装至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,加50ul RIPA冰上消化半小时,用枪吹打细胞RIPA液200次;
3、悬浮细胞或细胞冻存液细胞,转移至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,加1ml PBS重悬细胞,分装至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,加50ul RIPA冰上消化半小时,用枪吹打细胞RIPA液200次;
4、保存
上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(尽量避免反复冻融,否则会使样本蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月;
二、Western 实验中易碎组织(脑、肝、肾)的采集、处理和保存
1、样品大小50-100mg,按质量体积比1:5加入RIPA;
2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;
3、冰水浴中电动匀浆机(每个样本20-30s)或超声破碎;
4、保存
上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(尽量避免反复冻融,否则会使样本蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月;
三、Western 实验中不易碎组织如(心肌、肌肉组织)的采集、处理和保存
1、样品大小50-100mg,按质量体积比1:5加入RIPA;
2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;
3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;
4、保存(尽量避免反复冻融,否则会使样本蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月;
备注:心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆,组织块会绞入钻头形成团块,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎。
四、Western 实验中上皮组织(皮肤、膀胱、肠)的采集、处理和保存
1、样品大小50-100mg,按质量体积比1:5加入RIPA;
2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;
3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;
4、保存(尽量避免反复冻融,否则会使样本蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月
备注:上皮组织韧性较强,较难剪碎,需要增加组织破碎时间才能充分破碎。
五、Western 实验中小颗粒组织(如:神经节、小鼠眼角膜、巩膜、韧带)的采集、处理和保存
1、按样本大小加入适量的RIPA;
2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块;
3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;
4、保存(尽量避免反复冻融,否则会使样本蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月
备注:小颗粒组织量比较小,会有蛋白浓度量低于检测限度的风险,且样本量太少,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎;研磨时应格外细心。
六、Western 实验中骨头组织的采集、处理和保存
1、用已消毒过的咬骨钳将骨组织咬碎
2、加入适量RIPA,放入冰箱,浸泡半天,使骨头软化
3、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块
4、冰水浴中电动匀浆机(每个样本20-30s)或超声破碎;
5、保存
上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(尽量避免反复冻融,否则会使蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月
七、Western实验中全血的采集、处理和保存
1、采集血样,室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可;血量一般为1ml;
2、从全血中提取淋巴细胞后,加入100-200ul的RIPA裂解淋巴细胞;(全血提取淋巴细胞见附录)
3、超声破碎或用枪吹打200下;
4、保存;
将细胞放入冰箱冻存(尽量避免反复冻融,否则会使蛋白降解)
-20℃下,可放置保存1个月;
-80℃下,可放置保存6个月;
备注:全血千万不能放入干冰中送样,应室温保存