一、Western 实验中细胞的采集、处理和保存

1、贴壁细胞，加1ml PBS清洗，弃上清，加RIPA（六孔板200ul，培养瓶400ul）冰上消化半小时，细胞刮板，将RIPA转移至EP管，用枪吹打细胞RIPA液200次；

2、细胞团块，加1ml PBS重悬细胞，分装至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加50ul RIPA冰上消化半小时，用枪吹打细胞RIPA液200次；

3、悬浮细胞或细胞冻存液细胞，转移至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加1ml PBS重悬细胞，分装至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，加50ul RIPA冰上消化半小时，用枪吹打细胞RIPA液200次；

4、保存

  上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月；

二、Western 实验中易碎组织（脑、肝、肾）的采集、处理和保存

1、样品大小50-100mg，按质量体积比1:5加入RIPA；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中电动匀浆机（每个样本20-30s）或超声破碎；

4、保存

  上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月；

三、Western 实验中不易碎组织如（心肌、肌肉组织）的采集、处理和保存

1、样品大小50-100mg，按质量体积比1:5加入RIPA；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月；

备注：心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆，组织块会绞入钻头形成团块，无法被匀浆机刀头切碎，需用研磨或超声才能充分破碎。

四、Western 实验中上皮组织（皮肤、膀胱、肠）的采集、处理和保存

1、样品大小50-100mg，按质量体积比1:5加入RIPA；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月

备注：上皮组织韧性较强，较难剪碎，需要增加组织破碎时间才能充分破碎。

五、Western 实验中小颗粒组织（如：神经节、小鼠眼角膜、巩膜、韧带）的采集、处理和保存

1、按样本大小加入适量的RIPA；

2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎；

4、保存（尽量避免反复冻融，否则会使样本蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月

备注：小颗粒组织量比较小，会有蛋白浓度量低于检测限度的风险，且样本量太少，无法被匀浆机刀头切碎，需用研磨或超声才能充分破碎；研磨时应格外细心。

六、Western 实验中骨头组织的采集、处理和保存

 1、用已消毒过的咬骨钳将骨组织咬碎

 2、加入适量RIPA，放入冰箱，浸泡半天，使骨头软化

 3、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块

 4、冰水浴中电动匀浆机（每个样本20-30s）或超声破碎；

 5、保存

  上述步骤处理完后，将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使蛋白降解）

  -20℃下，可放置保存1个月；

  -80℃下，可放置保存6个月

七、Western实验中全血的采集、处理和保存

  1、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；

  2、从全血中提取淋巴细胞后，加入100-200ul的RIPA裂解淋巴细胞；（全血提取淋巴细胞见附录）

  3、超声破碎或用枪吹打200下；

  4、保存；

     将细胞放入冰箱冻存（尽量避免反复冻融，否则会使蛋白降解）

    -20℃下，可放置保存1个月；

    -80℃下，可放置保存6个月；

备注：全血千万不能放入干冰中送样，应室温保存