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本期小编将分享抗体的常见问题和解答，
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第二期
WB实验时为何要设置阳性对照？ 使用已知的阳性对照品对于确保Western Blot实验正常工作是至关重要的。 为何实际检测到的WB条带与预期的有所区别？ WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的，通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度要快。但是迁移率也是受到其他因素影响的，这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。主要有以下几种常见因素： 翻译后修饰－比如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量 翻译后剪切－ 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式，如pro-caspases 不同剪切体 – 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的 相对电荷（Relative charge） – 氨基酸的组成(charged vs non-charged) 多聚体－如二聚体或三聚体。这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件，因此造成检测的条带偏大。 Western Blot 中抗体的重复应用问题 抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？ 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗） 一抗，二抗的比例是否重要？ 比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。 如何确定抗体的稀释比例? 如果说明书中有推荐的稀释比例，请按照该稀释比例进行实验。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响，推荐浓度仅作为参考。 如何确定适用于某种特定抗体的抗原修复方法？ 有些抗体对抗原修复方式有特别要求的，一般在其说明书中都会有明确的标注和推荐。但是很多抗体并没有一个特别的推荐，就需要实验者自己来进行优化和摸索了。 如何保存抗体? 对于多数抗体而言，在抗体收到后应分装成小等份，并冻存于-20℃或-80℃是最佳选择。腹水形式的产品收到后需立即冻存，因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在置于4℃条件会导致抗体的降解。 如何分装抗体? 请根据一次实验的用量来分装抗体，但是每份不应该少于10ul。分装的体积越小，抗体浓度受蒸发和管壁吸附的影响越大。 如何选择同型对照？ 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。例如：一抗是FITC标记，其抗体分型是小鼠的IgG1，则同型对照要选择是FITC标记的小鼠的IgG1。